第1个回答 2019-01-21
pcr的技术的主要步骤及pcr引物设计的一般原则分述如下：
1、pcr的技术的主要步骤：
①dna变性：（90℃-96℃）：双链dna模板在热作用下，氢键断裂，形成单链dna
②退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与dna模板结合，形成局部双链。
③延伸：（70℃-75℃）：在taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dntp为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的dna链。
每一循环经过变性、退火和延伸，dna含量即增加一倍。如图所示：现在有些pcr因为扩增区很短，即使taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
2、引物设计的基本原则
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物碱基：g+c含量以40-60%为宜，g+c太少扩增效果不佳，g+c
过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。
③引物内部不应出现互补序列。
④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3
′端的互补重叠。
⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是g和c。
⑦引物的5
′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。