第1个回答 2022-11-19
多聚甲醛之所以能够起到很好的固定效果，和它的制作工艺、物理性质和化学性质是分不开的。
多聚甲醛多制成多聚甲醛固定液来进行固定，多聚甲醛液的配方决定了多聚甲醛的固定性，多聚甲醛液中含有pbs溶液，HCL，这些溶液和多聚甲醛按照一定的方法混合在一起就具有了个定作用。
pfa固定原理？
pfa的固定原理是：
当纯净甲醛在水溶液中溶解时，会自动聚合成长链的多聚甲醛。其长度不一，在水中同时进行聚合与解聚反应。甲醛易溶于脂类物质，因此能穿过细胞膜进入细胞内。用多聚甲醛固定细胞时，能使细胞内的自由氨基基团发生化学交联。当不同的分子发生交联时，形成一网状结构，把细胞的各个结构成分连接起来。
克隆细胞工程步骤？
1.取对数生长期的各组细胞，分别用0.25\%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10\%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2.将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5\% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3.经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4\%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。