胶质瘤是神经外科最常见的肿瘤，疗效欠佳。免疫治疗是针对恶性胶质瘤有效的生物治疗方法，其中树突状细胞（dendritic cell，DC）介导的免疫治疗是目前常用的方法，能延长胶质瘤患者生存期。我们前期研究发现胶质瘤干细胞样抗原（干细胞样细胞中提取的全肿瘤抗原）较传统的抗原具有更强的免疫原性，人体外试验及动物试验均已证实将该抗原荷载自体DC制备的疫苗有效，本研究着重探索该改良DC疫苗在临床应用的可行性、安全性及有效性。
材料与方法
1、患者入选标准：选取复发胶质瘤患者，临床诊断为复发恶性胶质瘤（WHO病理Ⅲ～Ⅳ级）；肿瘤全切或切除程度＞80（术后增强MRI证实）；预计生存期＞3个月；胶质瘤患者远期生活质量KPS（Karnofsky Performance Scale）≥60分；患者血液学指标满足以下条件：白细胞＞3×109/L,血红蛋白＞90g/L；肝肾功能正常（门冬氨酸氨基转移酶、谷氨酸丙氨酸氨基转移酶≤2倍标准正常值上限，肌酐≤150 μmol/L，尿素氮≤9 mmol/L）；同意加入本研究，并签署知情同意书。研究通过华山医院伦理委员会审批，相关患者及家属均详细告知，并签署知情同意书。
2、胶质瘤细胞原代培养：手术时取新鲜肿瘤标本，体外原代培养，步骤简述如下：将新鲜胶质瘤组织块洗净后剪碎，加入5～10倍体积的0、2胶原酶Ⅳ（Sigma）37℃孵箱中消化10 min，离心后用氯化铵红细胞裂解液裂解红细胞，钢网（孔径30 μm）过滤，制成单细胞悬液，按3×105个/cm2的密度用DMEM/F12培液（添加20 ng/μl bFGF、20 ng/μl EGF、20 ng/μl B27）接种于培养瓶，置5CO2孵箱37℃孵育。2-3 d换液，每周传代1次，相差显微镜下观察其形态。
3、CD133阳性干细胞样细胞分选：取部分原代培养的细胞（5×107～1×108个）制成肿瘤单细胞，按试剂盒说明书分别进行CD133/1（Miltenyi Biotec）流式和磁珠抗体标记，流式细胞仪检测CD133+细胞比例，CD133/1磁珠抗体（Miltenyi Biotec）标记后分选。磁珠分选方法如下：CD133/1磁珠抗体与细胞4℃共孵育10 min，PBS洗涤2次；500 μl PBS重悬细胞，将细胞悬液缓缓过柱；1 ml PBS洗柱2次，收集CD133-细胞；移去磁场，PBS洗涤收集CD133+细胞。CD133+和CD133-细胞分别用CD133/2流式抗体标记分析CD133+细胞比率。
4、干细胞样抗原及DC疫苗制备：收集上述分选后的CD133+细胞，X线（6 Gray，Varian 600C直线加速器，上海伽玛医院）辐照，收集细胞在液氮和37℃水浴中反复冻融3次，用吸管反复吹打，高速离心后得到的上清即为胶质瘤干细胞样抗原溶液。用标准的Bradford蛋白分析法测定浓度，PBS调整浓度为1 μg/μl，-20 ℃保存备用。采患者自体血15～20 ml，Ficoll淋巴细胞分离液（Cedarlane）分出单核细胞，接种于含GM-CSF和IL-4（RD Systems）的RPMI1640培液（Gibco）中。7 d后收集悬浮DC细胞，CD11c流式抗体标记，流式细胞仪分析，另与上述抗原37℃共培养18 h（抗原终浓度为150 μg/μl），检测抗原刺激后DCs表面分子如HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、CD80、CD86等表达[2]，了解DCs成熟情况。生理盐水洗涤后计数，并调整体积至0、5 ml。5、DC疫苗治疗联合化疗及相关指标检测：术后3 d内行头部增强MRI检查，观察手术切除情况。
术后4-8周内将上述方法制备的肿瘤DCs疫苗三角肌内注射。每1周注射1次，共注射3次。免疫治疗时观察生命体征、神经系统症状等。免疫治疗前（第1次抽血）和治疗后（第3次疫苗注射）采血5 ml，于华山医院检验科（College of American Pathologists认证）检测血常规（包括白细胞数目、淋巴细胞比例等）、肝肾功能、血钠、钾、钙等。免疫治疗后继续替莫唑胺（temozolomide,TMZ）化疗，方案为TMZ 200mg?m-2?d，连续口服5 d，28 d为1个周期。免疫治疗后每隔3个月左右行头部增强MRI检查及生存期随访。
结 果
1、患者资料小结：5例患者均符合入选标准，二次手术后病理为恶性胶质瘤。术后增强MRI证实其中4例全切，1例部分切除。第1次术后3例患者均接受了放疗、化疗，1例患者进行了局部伽玛刀治疗，1例未放、化疗。第2次术后5例患者均接受了3次疫苗注射的免疫治疗和替莫唑胺化疗。详细资料见表1。
2、胶质瘤细胞中的CD133+细胞：肿瘤细胞在无血清培液中悬浮球样生长（图1a），晃动培养瓶可见肿瘤球滚动。原代培养第3天取部分细胞制成单细胞悬液，CD133-1/PE抗体标记后流式细胞仪检测CD133+细胞比例，结果显示上述患者复发胶质瘤中均含有CD133+细胞，但比例各不相同。磁珠分选能不同程度地提高各胶质瘤细胞株中CD133+细胞比例（表2）。3、DC疫苗制备标准：干细胞样抗原刺激DCs使其表面HLA、CD86等分子表达增高，提示DCs成熟[2]，显微镜下见多数细胞聚集、悬浮并有指状突起，具备成熟DCs特征。流式检测结果表明诱导后CD11c阳性细胞纯度达（80±6、34）（图1b～e），DCs细胞数目可达3×106～5×106个（表2）。
4、免疫治疗前后相关指标：免疫治疗前后肝肾功能、电解质等无明显差异，且均在正常范围内。血常规中淋巴细胞比例由免疫治疗前（38±6、72）增高至（44、6±8、61），但差异无统计学意义（n=5,P=0、0592）。5例患者接种DC疫苗后有1例诉头晕，24 h内自行缓解。全部患者无头痛，无发热，无腹泻，无皮疹，无神经系统体征变化，亦无注射部位红肿等。
5、随访：术后3 d增强MRI证实4例患者肿瘤全切，术 多次随访增强MRI均未见肿瘤复发，目前仍在随访中，2例Ⅲ级患者生存期分别为72周和75周，2例Ⅳ级患者生存期为77周和80周。1例肿瘤部分切除患者病理为Ⅳ级胶质母细胞瘤，术后15周、免疫治疗后7周增强MRI和MRS证实残余肿瘤向对侧生长，术后30周、免疫治疗后22周可见肿瘤明显缩小，但术后53周残余肿瘤又进展（图2），术后57周死于肿瘤进展。
讨 论
随着免疫学日新月异的发展，人们对中枢神经免疫的认识已经从“免疫豁免（immune-privilege）”转变为“免疫特异（immune-special）”[4]，胶质瘤免疫治疗日益受到重视。高度恶性胶质瘤自身具有很强的免疫逃逸能力，手术切除肿瘤有助于减轻肿瘤诱发局部和全身免疫抑制[5]；胶质瘤周边的血脑屏障往往由于血管内皮生长因子上调、水相通道蛋白4表达增高、紧密联系断裂等因素导致通透性增高，有利于系统免疫细胞等进入脑内[4]，这些免疫特性引发人们对胶质瘤免疫治疗的兴趣。
DC是目前所知最强的专职性抗原递呈细胞，能摄取、加工和递呈抗原，具有强大的激活T细胞的能力，参与体内免疫反应，在肿瘤免疫应答反应中处于核心地位。为了增强机体的免疫应答，往往体外将肿瘤抗原导入DC来激发对肿瘤细胞的免疫反应，即肿瘤DC疫苗。
其优点在于：
（1）特异性识别肿瘤细胞，目标性强，不良反应小；
（2）与放、化疗联合应用，可产生优于单一治疗的效果；
（3）免疫治疗中产生的记忆细胞有助于防治复发。DC疫苗治疗胶质瘤已有临床Ⅰ/Ⅱ期实验研究证实安全有效，YU等[6]为恶性胶质瘤患者接种了肿瘤裂解物致敏的DC细胞，患者生存期明显延长，再次手术的肿瘤标本中有CD8+T细胞浸润和记忆细胞。
国内薛德麟等[7]人为胶质瘤患者接种肿瘤组织匀浆制备的DC疫苗，同样能延长患者生存期。尽管如此，胶质瘤特异性抗原的缺乏限制了胶质瘤免疫治疗的进一步发展。虽然胶质瘤表达多种相关抗原如变异型EGFR、IL-13R、tenascin等[4]，但上述抗原表达并非普遍表达的胶质瘤抗原。目前公认肿瘤混合抗原致敏DC是治疗胶质瘤较安全有效的方法之一[5]，但混合抗原本身存在着抗原性弱的缺点。我们前期研究发现从胶质瘤干细胞样细胞提取的肿瘤混合抗原，即干细胞样抗原，较传统的抗原免疫原性更强[2]。干细胞样抗原致敏DC疫苗目前仅有体外实验[2]和小鼠动物实验[3]（其干细胞样抗原由未分选细胞获得），目前尚无临床研究。基于此，本研究将胶质瘤干细胞样抗原致敏DC疫苗应用于恶性胶质瘤患者观察其可行性、安全性、有效性。本研究入选的患者均为复发和术后经病理证实为恶性胶质瘤，恶性胶质瘤治疗首选手术，免疫治疗作为术后辅助治疗适合于微小病灶或散在的肿瘤细胞。
另有报道替莫唑胺能延长胶质瘤患者生存期[8]，而疫苗可以增强胶质瘤化疗疗效[9]，故我们将两者联合。但由于化疗能显著降低白细胞，故建议免疫治疗先于化疗。本研究中复发胶质瘤患者经DC疫苗治疗后无明显不良反应，无自身免疫等现象，2例Ⅲ级患者生存期分别为72周和75周，3例Ⅳ级患者生存期为57周、77周、80周，平均生存时间为72、2周，随访工作及本研究工作仍在进行中。YU等[10]人研究DC疫苗组平均生存期约133周；对照组为复发胶质瘤，进行了手术和放疗后平均生存期约33周。张晓实[5]综合文献发现目前复发胶质瘤术后生存期约25、7周。由此可见，本研究中改良的DC疫苗安全有效，DC疫苗联合替莫唑胺化疗能延长患者生存期。虽然胶质瘤免疫治疗有效，但现有各种DC疫苗均存在一定的缺点，如何增进其疗效仍困难重重。
此外，如何简化流程并将其产业化均有待努力。另由于本文例数有限，胶质瘤DC疫苗的安全性及疗效有待我们更细致、更深入的观察。
详情