实时荧光定量PCR不是用来测浓度的,可以用来做基因的拷贝数。但是如果你的产物单一,有相应的标准品,也是可以测浓度的,浓度的准确性和你的标准曲线相关。
实时荧光定量PCR:
实时荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR,RTFQ PCR) 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。
检测指标是:各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
精确测定DNA浓度的方法:
DNA纯度和浓度的检测:分光光度(紫外吸收)法
1.预热紫外分光光度计10-20分钟。
2.取所需的比色杯(4ml),其中一只装入3 mlH2O溶液,作为空白液,用来校正分光光度计零点及调整透光度至100。
3. DNA纯度及浓度的测定:
①取3微升的DNA样品加入比色杯,加dH2O至3000微升,混匀。
②将比色杯置入分光光度计中,调入射光波长,分别用空白溶液调整零点(T为100,OD为0),测待测样品在260nm、280nm、230nm的OD值。
③计算浓度:
DNA浓度(ug/ml)=A260×50ug/ml×稀释倍数
对于双链DNA 1.0 OD260=50 ug/ml
对于单链RNA 1.0 OD260=40 ug/ml
4. 纯的DNA溶液其OD260/OD280应为1.8,OD260/OD230应大于2.0。
⑴ OD260/OD280大于1.9时,说明有RNA污染,小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。