免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 · 具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
– 对抗体的要求：纯度高、比活性强；
· 高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
– 对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。 · 抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：
– 免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；
– 免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
· 根据抗原是否显示免疫原性分为：
– 完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。
· 免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
– 半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
· 半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载 体
· 通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
– 常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
– 用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。 1、抗体的概念：
· 机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。
– 抗体主要存在于血清内；
– 抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。
– 免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。
2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。
· 单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。
– 特异性强、抗体产量高。
· 多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
– 特异性低，会产生抗体的交叉反应。
– 多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。
– 抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。
3、抗体的制备——多克隆抗体的制备
· 动物的选择
· 佐剂(adjuvant)
· 免疫方法
· 免疫剂量
· 抗体效价的测定
· 放血或定期抽血
(1) 动物的选择
选择什么动物来免疫取决于：
· 所需抗血清的量
– 小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。
· 能供免疫用的抗原量
– 小鼠50μg足够，而山羊需要几毫克。
(1) 动物的选择(续)
· 动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。
– 例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。
– 常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。
(2) 佐剂 (adjuvant)
· 一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长滞留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。
· 最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为：
– 弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)
– 弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)
弗氏不完全佐剂
(Freund's incomplete adjuvant, FIA)
· 是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。
· 使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。
弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant, FCA)
· 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2～20mg/ml)，即成为FCA。
· 免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。
– 一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。
佐剂与抗原乳化的方法
· 研磨法：适于制备大量的佐剂抗原
– 先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。
– 按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。
· 缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
· 注射器混合法
– 将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。
· 优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。
· 缺点：不易乳化，时间长。
佐剂与抗原乳化的方法(续)
· 快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。
– 将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。
– 每次乳化 10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。
· 优点：简单、快速、节省材料。
乳化剂的鉴定
· 判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。
(3) 免疫方法——免疫途径
· 常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。
· 一般采用多点注射方法
– 常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。
– 皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。
(3) 免疫方法——免疫途径 (续)
· 几点说明：
– 大动物一般不用腹腔注射
– 颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射
– 抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100g抗原即可获得较好的免疫效果。
– 皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。
(3) 免疫方法——次数及间隔时间
· 次数一般为2～3次(初次免疫和加强免疫)
– 首次注射后，10～15天再加强注射；
– 剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。
· 间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长
– 豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；
– 第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。
举例1：家兔的免疫
· 初次免疫
– 用50～200g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；
· 两周后，加强免疫
– 将50～200g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；
· 抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血
– 抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。
举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔
· 一般选择2.5～3.0kg的新西兰种公兔
– 先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)；
– 10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化；
– 以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为25～50g；
– 末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。
举例3：豚鼠和大鼠的免疫
· 初次免疫
– 用10～100g Ag加入FCA，在背部皮内注射4～6点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射；
· 加强免疫
– 每隔 7～8天，将10～50g Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；
· 抗体效价的检测
(4) 免疫剂量
· 抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；
· 免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。
(4) 免疫剂量 (续)
· 各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量
(5) 抗体效价的检测
多采免疫双向扩散法
【基本原理】
· 指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。
– 将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
· 优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。
免疫双向扩散法的操作步骤
· 将玻璃板用水洗净后用75%乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。
· 将l % agar 融化后，置56C水浴。
· 在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔(直径 3rnm)，孔间距10mm。
· 中心孔加5l 抗原样品，周围孔内每孔加5l 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。
· 凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。
· 观察结果。
抗体效价检测的其它方法
· 环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；
· 对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；
· 酶联免疫吸附试验 (ELISA)。
(6) 放血或定期抽血
常用以下3种方法
· 颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。
· 心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。
· 静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。
(6) 放血或定期抽血 (续)
· 采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血
· 血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价；
· 加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。
