1565年7月29日，在圣十字架宫，玛丽出人意料地嫁给了达恩利勋爵亨利·斯图亚特，他是英格兰亨利七世的长女玛格丽特·都铎与第二位丈夫安格斯伯爵阿齐巴尔德·道格拉斯的外孙，也就是玛丽的表兄，同时亨利·斯图亚特的父系祖先可以追溯到第四代苏格兰王家大管家亚历山大·斯图亚特的次子约翰·斯图亚特爵士。对于新教首领，同时也是她的私生兄弟，莫里伯爵而言，这是突然一击。他们公然发动叛乱，玛丽不得不于1565年8月26日逃往斯特灵去组织力量进行抵抗。9月，玛丽又前往爱丁堡招募更多军队。莫里伯爵和其他起兵的贵族被击败了，决定胜负的战斗即是后来广为人知的蔡斯袭击。玛丽与达恩利的联姻激怒了伊丽莎白：她认为这次婚姻尽管已经完成但是应该得到她的许可。因为达恩利的英格兰贵族头衔。伊丽莎白觉察到这次婚姻带给她本人的威胁。因为达恩利具有英格兰和苏格兰王室的血统，任何达恩利和玛丽的子女都极有可能去继承玛丽和伊丽莎白王位。
不久以后，玛丽就怀孕了。但达恩利很快就变得傲慢自大，桀骜不逊，贪求权力，要求在他的头衔上赠以“国王”的名号。但在某一场合，他袭击了玛丽，试图想让玛丽因此流产，却失败了。他嫉妒玛丽与她私人秘书，大卫·里齐奥之间的情谊，在1566年3月，达恩利进入参与了一个在蔡斯袭击中反叛玛丽的贵族组成的秘谋组织。3月9日，一个贵族团体，伙同达恩利，在斯特林宫刺杀了里齐奥，当时他和玛丽、阿艾尔夫人等正在玩纸牌。这次行动加速了玛丽与达恩利婚姻的破裂。达恩利很快再次改变了立场与那些参与刺杀的贵族决裂。
随着1566年7月，玛丽的继承人（即以后的英格兰詹姆士一世、苏格兰詹姆士六世）出世，一个除掉达恩利的阴谋正逐渐形成，因为此时玛丽无可救药爱上了一个黑色大理石一样的男人--博思韦尔伯爵，伯爵粗狂豪放的男性魅力瞬间将玛丽从未失去的骄傲、自信及理性碾的粉碎，和伯爵相比，弟弟一样的弗朗索瓦二世和徒有外表的小白脸达恩利完全失去了色彩。她曾写诗自供“为了他，从那天起，我放弃了名誉；为了他，我赌上了权势和良心；为了他，我抛弃了亲人和好友 。”
此时的达恩利正重病缠身（有可能是梅毒），他被安排在爱丁堡的一幢别墅里康复。1567年2月，别墅里发生了一次爆炸，爆炸发生后，在花园里发现了已经咽气的达恩利。他看起来是被掐死的。这一事件原本是对玛丽的一种解脱，却不想败坏了她的名誉。大家都把注意力放到了博思韦尔伯爵身上，认为他刺杀了达恩利，由此招致了一场对博斯维尔的审判，但最后法庭宣判他无罪。玛丽试图在贵族中重新寻找支持。他们中的一部分就是在伯斯维尔曾经笼络过签署了埃斯里客栈联合声明，支持他迎娶玛丽的贵族。
1567年4月24日，玛丽最后一次在斯特灵探视了她的儿子。在她返回爱丁堡的路上她宣称自己遭到了“绑架”。无论是否出于玛丽的自愿，当博斯维尔和他的手下将她带回邓巴城堡时，据说她被博斯维尔伯爵强奸了，但其实在更早于达恩利身亡之前，她就已怀上博斯维尔的小孩。5月6日，他们返回到爱丁堡，5月15日，在圣十字架宫，玛丽和博斯维尔伯爵举行了新教仪式的婚礼。然后这段婚姻并不圆满，玛丽在婚后两天就喊着要一把刀来自杀，同时她也被怀疑她的臣民们视为淫妇。贵族们都转而反对玛丽和博斯维尔伯爵并起兵反叛。6月15日玛丽和博斯维尔伯爵不得不退到卡伯里山上对抗贵族军队。战斗没有打响，玛丽以释放博斯维尔伯爵的条件下答应了贵族的要求。但是贵族们没有信守他们的承诺并将她带到爱丁堡囚禁在列文湖城堡，这个城堡坐落在列文湖中央小岛上。从1567年7月18日到24日，玛丽怀的一对双胞胎在城堡里流产了。7月24日，她被迫退位并将王位传给只有一岁大的詹姆士。
