虽然大肠杆菌E.coli 表达系统经济实惠,但由于缺乏重要的脂类,分子螫合物,以及重要的翻译后修饰,用它表达真核蛋白,可能会影响蛋白本身的折叠及功能,以膜蛋白为例,大肠杆菌表达系统能影响目标蛋白在细胞膜的插入位置、及其应有的功能[1]。除此之外,当目标蛋白大于 50kDa 时,使用大肠杆菌系统可能表达出不完整的蛋白[2]。
先前已经提到 Strep-tag® 的历史(点此回顾),现在我们将着重介绍 Strep-tag® 在哺乳类细胞表达系统的应用。
虽然大肠杆菌E.coli 表达系统经济实惠,但由于缺乏重要的脂类,分子螫合物,以及重要的翻译后修饰,用它表达真核蛋白,可能会影响蛋白本身的折叠及功能,以膜蛋白为例,大肠杆菌表达系统能影响目标蛋白在细胞膜的插入位置、及其应有的功能[1]。除此之外,当目标蛋白大于 50kDa 时,使用大肠杆菌系统可能表达出不完整的蛋白[2]。
所以,为了研究特定蛋白的功能(如:信号通路)、生产较大型的蛋白,或进行高解析度的结构分析,愈来愈多的实验组选择哺乳类表达系统来生产融合蛋白。其原因为哺乳动物细胞生产出的重组蛋白与人类蛋白十分相似,有较完整的蛋白折叠、组合及翻译后修饰[3]。因此,愈来愈多科学家们更加关注于—如何从哺乳类细胞中高效的纯化目标蛋白。
亲和标签的选择
首先,需考虑选择合适的亲和标签。常用于哺乳动物表达系统的亲和标签有 His-tag、FLAG-tag、GST-tag及 Strep-tag® 等[4-12],整理于下表:
这些亲和标签在使用上各有千秋。
使用 His-tag 时,常遇到的问题是寄主蛋白与填料的非特异性结合,在哺乳动物重组蛋白的纯化过程中,这样的情况更为明显。由于系统中有很多含有组氨酸(histidine)的残基的蛋白,这种蛋白结构与 his-tag 相似,容易与镍柱结合,因此导致目标蛋白纯度降低[13]。
FLAG-tag 系统可在非变性条件下进行纯化,能得到高纯度、有活性的蛋白,但其缺点为纯化介质较为不稳定,且纯化成本高上许多[5]。
另一常用的标签为GST-tag,一个26kDa 的蛋白,其特点是表达量高,具高度抗原性,常用来增加目标蛋白的溶解度,但常常会影响目标蛋白的特性,一般推荐纯化后将标签去除[8]。
而Strep-tag®(包含Strep-tag®II或是Twin-Strep-tag®),都是短肽标签,分别为8 或28 个胺基酸,一般不干扰蛋白折叠或活性,因此适合用于蛋白功能性研究[5]。 Strep-tag® 可以特异性的结合在 Strep-Tactin® (二代介质) 或 Strep-Tactin®XT (三代介质) 的生物素的结合位点。洗脱时使用的脱硫生物素(适用于二代)或生物素(三代),对同样的结合位点有更高的亲和力,能将目标蛋白从同样位置移除,因此得到的目标蛋白纯度一般高于95%[12]。
同时,三代Strep-Tactin®XT 与Strep-tag® 蛋白的亲和力大幅提升,直接加入含目标蛋白的哺乳细胞的培养上清,即可高效纯化出所需蛋白(注: 原本使用二代需先以Avidin 或是BioLock 将培养基中的生物素遮蔽,才不会影响纯化表现)。
三代 Strep-Tactin®XT 亲和力显著
图 A 比较了 His-tag 与 Strep-tag® 直接加入哺乳细胞培养上清纯化目标蛋白的表现。
图A:分别向Strep-Tactin®XT High Capacity 1ml 重力柱(左)和Ni-NTA 1ml 重力柱(右)中,同时加入含4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST) 或mCherry-His-tag (His) 萤光蛋白的ExpiCHO 细胞培养上清(注: 接下来的实验皆是取哺乳细胞表达某抗体后的上清,另加入高纯度目标蛋白进行实验)。由图可见,Strep-Tactin®XT(左)能高效率的捕捉 mCherry-TST,而右方的 mCherry-His 几乎无法挂柱。
此外,我们也测试了其他的蛋白,例如 SEAP (72 kDa) 或抗体 (mAb,其重炼为 55 kDa)。图 B 为以 Strep-Tactin®XT 纯化 SEAP-TST、mCherry-TST与 mAb-TST 的 SDS-PAGE 分析结果,可见对于不同蛋白,Strep-tag® 系统都能纯化出高纯度的目标蛋白。 (注: 红色标记处为 mCherry 的降解产物,非杂带)
图B
因 Strep-Tactin®XT 与 Twin-Strep-tag 蛋白的高亲和力,即使目标蛋白的浓度低,使用 Strep-Tactin®XT 仍可以有效的捕捉上清中的目标蛋白。表 C 整理了几个实验的数据,显示当目标蛋白浓度低于 20 μl/ml 时,得率仍能达到几近 100%。
表C
Strep-Tactin®XT 普适性高
除了上述实验所用的 CHO 细胞株外(中国仓鼠卵巢细胞),另一常用于生产蛋白的哺乳动物细胞株为 HEK293(人胚胎肾细胞),使用上较 CHO 简单。我们测试了 Strep-Tactin®XT 的纯化表现 : 表 D1 为以 Expi293 表达 SEAP-TST 或 mCherry-TST 蛋白后,目标蛋白的浓度。图 D2 为纯化表现的 SDS-PAGE 分析。从中可知,与 ExpiCHO 培养基相同,直接将表达好的 Expi293 上清加入 1 ml Strep-Tactin®XT 高载量重力柱中进行纯化,一样能够快速的得到高纯度的目标蛋白。
表D1
图D2
综上所述,Strep-tag® 非常适合用在哺乳动物细胞系中表达目标蛋白,其纯化过程也与常见的 ExpiCHO 及 Expi293 培养基相容,不须另外处理,让实验流程更为便利。加上 Strep-tag® 系统在纯度上的优势,是目前在这个应用上的绝佳选择。
参考文献
1. Sahdev S, Khattar SK, Saini KS (2008). Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Mol Cell Biochem., 307(1-2):249-64
2. Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, Mccafferty J (2004). Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of protein features that correlate with successful expression. BMC Biotechnol., 4:32. doi: 10.1186 /1472-6750-4-32
3. Khan KH (2013). Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications. Adv Pharm Bull., 3(2): 257-63. doi: 10.5681/apb.2013.042
4. Wegner GJ, Lee HJ, Corn RM (2002). Characterization and optimization of peptide arrays for the study of epitope-antibody interactions using surface pla *** on resonance imaging. Anal Chem., 74(20):5161-8.
5. Terpe K (2003). Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to mercial systems. Appl.Microbiol.Biotechnol.,60(5): 523-33. doi: 10.1007/s00253-002-1158-6
6. Lichty JJ, Malecki JL, Agnew HD, Michelson-Horowitz DJ, Tan S (2005). Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif., 41(1):98-105.
7. Tessema M, Simons PC, Cimino DF, Sanchez L, Waller A, Posner RG, Wandinger-Ness A, Prossnitz ER, Sklar LA (2006). Glutathione-S-transferase-green fluorescent protein fusion protein reveals slow dissociation from high site density beads and measures free GSH. Cytometry A., 69(5):326-34.
8. Kimple ME, Brill AL, Pasker RL (2013). Overview of affinity tags for protein purification.Curr Protoc Protein Sci., 73: Unit 9.9. doi: 10.1002/0471140864.ps0909s73.
9. GE Healthcare (2016). Affinity Chromatography Handbook, Vol. 2: Tagged Proteins.
10. Thermo Fisher Scientific (2015). Protein Expression Handbook
11. Dynamic Biosensors (2018) Application Note: High-affinity capturing of tagged proteins on the switchSENSE® biochip using Strep-Tactin®XT.
12. IBA Lifesciences (2016) Application Note: Strep-Tactin®XT:Twin-Strep-tag®- Advantages pared to the His-tag purification system.
13. Bornhorst JA, Falke JJ (2000). Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol., 326:245-54.
题图来源:shutterstock 正版图库
图片来源:iba
文章来源:iba
话题: Strep-Tactin®XT, 亲和标签