1、底物浓度:除选择适合的底物外,在实际应用中更多考虑的是底物浓度。由于[S]与反应速度V成双曲线关系,在酶活性测定时,要求[S]达到一定水平以保证酶活性与酶量成正比。
2、酶浓度:在反应条件一定时,酶浓度与反应速度成正比。按照中间产物学说,只有[S]>>[E]时,酶才能被底物分子饱和,反应速度才能达到最大值。因此当标本酶活力过高时,应将标本适当稀释后再加以测定。
3、温度:不同的酶最适温度可以不同,多数酶的最适温度在37~40℃。高于或低于最适温度,酶活性都降低。
4、离子强度和pH值:在最适pH时,酶的活性最强,高于或低于最适pH,酶的活性都降低。
一般采用电化学和光物理的方法
即利用反应物或产物的吸光性,用紫外分光光度法或荧光法测定。若酶反应过程中产物或反应物有气体,则可用测压仪(瓦氏呼吸仪)测定。若反应过程中生成酸,则可用电化学法。用同位素标记的底物则可用放射化学法测定底物浓度变化,计算酶活性。一些性质稳定的酶,也可用高效液相色谱法检测。
以上内容参考:百度百科-酶活性测定
(1)酶促反应过程中,要用初速度表示酶促反应速度。
(2)要规定时间、温度、pH等反应条件,并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定。
(3)配制的底物浓度应准确且足够大,底物液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中,以防止底物被分解。
(4)标本要新鲜,应保存于冰箱中。用血浆时,应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。在采血、分离血清时,应注意防止溶血和白细胞的破裂。
(5)在测定过程中,所用仪器应绝对清洁,不应含有酶的抑制物,如酸、碱及蛋白沉淀剂等。
测定酶活力方法介绍:
终点法:该方式是在特定条件下,将样品中要检知的酶作用一定量的底物,然后根据反应进行到某一程度(即达到某一指标)所需要的时间长短来估计酶的活力。
其一个发展是采用检测器对反应进行连续跟踪,并在反应达到某一程度时,精确地自动记录所需要的时间,这就是酶分析自动化中的固定浓度法;另一个发展是作成简便的酶检测纸片。
动力学法:该方式测定原理是在一定条件下,酶促反应速度和酶浓度成正比,因此测得反应速度就需要求得酶浓度。待测的酶浓度是影响反应速度的唯一因素,其他因素都应处于最适于酶发挥催化作用的水平,为此应选择适宜的底物浓度、缓冲体系、温度,并向反应系统中添加必要的辅助因子。
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