鬼笔环肽染料的染色方法：
鬼笔环肽 (phalloidin) 是一种双环七肽毒素，它能选择性的与动植物体内的纤维状的肌动蛋白 (F-actin) 结合，这种特殊的选择性使之成为研究细胞内肌动蛋白微丝 (F-actin) 的有力工具。在光学显微镜下, 荧光标记过的鬼笔环肽 (phalloidin-dye conjugate) 可以清晰地显示出细胞内微丝的形态和分布，广泛被应用于生物医学的研究当中。常用来标记鬼笔环肽的荧光染料包括以下几种：FITC, Rhodamine, TRITC or similar dyes, such as Alexa Fluor® 488 or iFluor 488.
由于鬼笔环肽无法穿越细胞膜， 所以不能直接应用于活细胞的染色；鬼笔环肽实验所用的样品在染色前需要固定， 例如可以用甲醛固定和透化细胞或组织切片，此外标记过的鬼笔环肽也可染色去石蜡后的石蜡包埋的样品。
有什么注意事项：
鬼笔环肽对pH敏感：提高pH会使结构中关键的硫醚桥键被切断，导致鬼笔环肽失去和肌动蛋白的亲和力。
根据 GLP（Good Laboratory Practice）操作要求，鬼笔环肽具有2mg / kg的 LD50 毒性。但是，实验使用的浓度很低，不会造成重大的危险。
鬼笔环肽染色可与抗体一起使用，可以添加在一抗或二抗孵育步骤时共染。
鬼笔环肽缀合物染色的最佳浓度和孵育时间根据细胞类型，固定条件，样品制备过程 或细胞与组织的通透性不同而有所变化。
避免使用含有甲醇或丙酮的固定剂，这些会破坏肌动蛋白的结构而影响鬼笔环肽染色效果。
悬浮细胞可以使用 poly-D-Lysine 的板或盖玻片贴壁，然后使用贴壁细胞方案染色。
用 PBS+ 1％BSA 的溶液提前孵育一下固定细胞20-30分钟，可能会改善染色。
在使用盖玻片上的细胞染色时，尽量将盖玻片置于有盖子的容器中以减少蒸发。
如果细胞看起来不是非常健康，可以在染色和洗涤时加入 2–10% serum。
当用于未固定的样品时，鬼笔环肽与肌动蛋白 (actin) 的结合会导致微丝末端的解离速率降低，通过防止长丝解聚来稳定肌动蛋白丝 (actin)。
贴壁细胞染色;
在黑色壁/透明底96孔板中培养细胞，细胞生长至总面积的70%－80%。
细胞也可以直接在培养皿内的盖玻片上培养。
吸出弃去细胞培养基（小心避免移动细胞）。
用PBS洗一次。
悬浮细胞染色：
培养细胞，生长至总体积的70%－80%。
1,000 rpm 离心细胞5分钟，弃上清液，保留细胞沉淀。
用37°C提前预热过的生长培养基中重悬细胞沉淀，转移到微孔板或盖玻片上。
吸出弃去细胞培养基（小心避免移动细胞），用PBS洗一次。
细胞染色的方法
荧光标记的 Phalloidin 比较好的试剂推荐使用AAT Bioquest:Phalloidin-iFluor 488
Phalloidin-iFluor 405;Phalloidin-iFluor 555;Phalloidin-iFluor 647,我们做实验经常会用的到，希望我们可以多多讨论，共同学习。
追问那细胞染色的具体方法是什么？实验中会用到哪些试剂？
追答细胞染色的方法
在室温下用3-4%的甲醛/ PBS 液固定细胞 10-30min。
吸弃固定液，用PBS洗涤细胞2-3次。
注意：可以在 PBS 中加入 10 mM ethanolamine (or 0.1 M glycine) 反应5min 来淬灭过量的甲醛。然后在固定的细胞中加入 PBS+0.1％Triton X-100 孵育 3-5分钟来增加细胞的通透性，然后再用 PBS 洗涤细胞2-3次。
添加鬼笔环肽 - 缀合物工作溶液 (Phalloidin-conjugate working solution)， 在室温条件下孵育20-90分钟
注意：可在此时加入 DNA 染色染料。
注意：对于脊椎动物细胞，可以将鬼笔环肽 - 缀合物添加到的PBS洗液洗涤，然后可加封片剂（mounting medium）封片。
用 PBS 冲洗细胞2-3次，每次冲洗5分钟。
用盖玻片加封片剂封片，保持荧光。
在荧光显微镜下观察细胞， 使用 Ex / Em = 493/517 nm 的滤光片（filter）。
实验中需要用到的试剂：
鬼笔环肽荧光结合物： 根据实验说明配置成溶液，建议加入1％的BSA来减少鬼笔环肽与管壁结合带来的损失。
PBS
不含甲醇的福尔马林溶液
Triton X-100
固封液：我们建议使用 Fluoroshield（ab104135）来降低光致褪色，或者使用含50％甘油/PBS加光褪色抑制剂（anti-fading reagent）, 如对苯二胺 (p-phenylene diamine) or或没食子酸丙酯 (N-propyl gallate)。
其他可选试剂：BSA，乙醇胺（ethanolamine），甘氨酸（glycine），DNA染色染料（DNA staining dye） 和溶血磷脂酰胆碱(LPC：lysopalmitoylphosphatidylcholine)。