做DNA检测
谁说DNA测序必须用上用显微镜啊？
DNA测序技术
测序目的
测定未知序列
确定重组DNA的方向与结构
对突变进行定位和鉴定
比较研究
测序技术发展
70年代末,Walter Gilbert发明化学法
Frederick Sanger发明双脱氧终止法
手动测序,同位素标记
80年代中期,出现自动测序仪(应用双脱氧终止法原理)
荧光代替同位素,计算机图象识别
90年代中期,测序仪重大改进
集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳
2001年完成人类基因组框架图
双脱氧终止法测序原理
利用DNA聚合酶的酶促特点
以单链为模板合成DNA的互补链
利用2',3'双脱氧核苷三磷酸作底物,使之连接在DNA链的3'末段,终止链的延长.
化学修饰法测序原理
化学试剂处理末段DNA片段,造成碱基的特
异性切割,产生一组具有各种不同长度的
DNA链的反应混合物,经凝胶电泳分离.
化学切割反应
包括碱基的修饰
修饰的碱基从其糖环上转移出去
在失去碱基的糖环处DNA断裂
化学法的优缺点
优点
模板不需体外酶促反应,只要末段标记的DNA片段
无论单链或双链
分别标记3'端和5'端可进行双侧读取
检测短的寡核苷酸片段
缺点
方法复杂费时
末段标记比活性低
测序片段长度250个左右,较短
测序方法(一)
测序方法(二)
自动测序技术
确定四种荧光发色基团标记4种脱氧核糖核酸(ddNTP)
——即赋予四组DNA以不同的"颜色"
荧光基团选择标准
标记方法
标记引物
特定的荧光标记引物与特定的ddNTP保持一致
管1 5'●— + ddATP
管2 5'◆— + ddCTP
管3 5'★— + ddGTP
管4 5'▲— + ddTTP
标记底物
将荧光素连在4种ddNTP
ddATP● ddCTP◆ ddGTP★ ddTTP▲
测序反应流程
待测模板
准备DNA模板
计算待测模板用量
DNA模板的使用量依据DNA的形式而定
质粒模板变性
96℃,2分钟,冷却至室温后加入其他成分(PCR产物不需变性).
PCR反应成分
1μl测序引物(3.2pmol/μl)
4μl测序专用Premix
包括10×Buffer,
dNTP MIX
ddUTP Dye Terminator
ddGTP Dye Terminator
ddCTP Dye Terminator
ddATP Dye Terminator
Polymerase Enzyme
用水补足反应体积至10μl
PCR反应条件:96℃,20秒,55℃,20秒,60℃,4分钟, 共30个循环.
反应终止及产物纯化
加入反应终止液2.5μl(组成为:NaAc 3M,EDTA 0.1M,Glycogen 20mg/ml).
95%冰乙醇沉淀并离心,70%冰乙醇洗涤并离心.
真空抽干沉淀,加入40μl甲酰胺.
加入样品板开始测序
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