第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：
第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国螺旋生物(Helicos)的SMS技术和美国太平洋生物(Pacific Bioscience)的SMRT技术。脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔 来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。
目前，有几种方法可以提高三代的质量:升级硬件。
这是最直接和最有效的，直接提高了那些硬件短板的规格。
但这也是最不可能的。
- 由于升级了所有的硬件，所以需要消耗整个测序器的硬件。
目前，PacBio并没有盈利。
与Illumina公司相比，PacBio在硬件上的利润率很低。
据业内人士估计，照明的成本大约在100000美元，PacBio价格略高于照明，但高成本几倍，激光光路和传感器。
建立和优化样本是一个主要困难。
- 这三代测序技术的特点比较汇总在以下中。其中测序成本，读长和通量是评估该测序技术先进与否的三个重要指标。
第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外，其测序核心原理（除Solid是边连接边测序之外）都是基于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，同时提高读长，并要保持二代技术的高通量。
我认为许多人错误的认为三代测序PacBio的危害是，通量不足。如果通量不是一个限制因素，PacBio是目前最准确的方法：测序错误率可以无限接近的罕见突变的发生率（即，它是不可能区分排序错误或罕见的突变）。因为三代错误完全是随机的，可以通过覆盖率来校正，如果系统出错，就无法纠正。
目前，改善三代通量的方法有多种。
先从最基本的说，硬件升级。这是直接提高硬件短板规格的最直接有效的方法。但那是最不可能的。因为任何升级短板硬件，都有音序器硬件和耗材。根据目前PacBio公司的财务报表，它尚未实现盈利。
相反，Illumina PacBio有硬件上的一个非常小的利润。据业内人士估计，Illumina的成本估计约为6 ~ 10美元每单位（零售价加0）。PacBio的销售价格略高于公司，但成本比激光光和感光元件高几倍。
还有的就是，提高加载速率。主要的难点是建筑物和样品的优化。提高聚合酶链反应并保持准确性。这是当前PacBio的主要努力。每个细胞5w序列，然后如果10KB长度平均读长，输出为5 x 10 ^ 8，即500m数据。增加15kb 750米。目前，在p6c4试剂，大约每SMRT细胞可以达到600m到1G数据流量，和个人用户实现2G（这是DNA的提取及数据库优化）。