cDNA文库合成过程中如何确保双链的准确性和完整性？

Question

如题所述

Answer 1

在cDNA文库的构建过程中，首先通过Superscript II—RT进行双链合成。步骤如下：

1. 在RNase-free PCR管中，加入500ng xul mRNA、Xho I Primer（1.4ug/ul）和适量水，混合后70℃反应10分钟，随后置于冰上冷却5分钟。
2. 加入5×first strand buffer、0.1M DTT、10mM dNTP和Superscript II—RT，42℃反应50分钟，然后70℃灭活酶。

完成第一链合成后，取部分产物冷藏，其余合并进行第二链合成。加入DNA Polymerase I buffer、dNTP、ddH₂O、RNase H、DNA Polymerase I等试剂，16℃反应2.5小时，70℃灭活，得到200ul cDNA第二链反应体系。

接着进行末端补平，加入T4 DNA Polymerase、BSA等进行37℃反应，通过酚/氯仿/异戊醇步骤纯化，然后用PCR纯化试剂盒进一步提纯。补平后的产物需与EcoR I adaptor连接，4℃放置30分钟后，通过T4 DNA Ligase连接并进行磷酸化和Xho I酶切。

最后，使用小胶回收cDNA片段，通过电泳切割不同大小范围的片段，再通过QIAEX II系统进行纯化，得到所需的cDNA。在整个过程中，务必注意所有步骤的温度控制和试剂的正确添加。

扩展资料

以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。