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cdna第二链的合成
cdna第二
条
链的合成
方法优缺点比较
答:
末端转移酶加尾法,用RNaseH、DNA聚合酶与连接酶合成法
。1、末端转移酶加尾法:优点为避免购买昂贵的第二链合成试剂盒,更容易在CDNA两端引入不同的已知序列,不会出现两种引物的交叉污染,而缺点为末端转移酶加尾法无法满足任何需求,最佳的策略是根据研究材料和研究问题的特点,结合自己的实际情况,选择...
常用于
合成cDNA第二
条
链的
酶是
答:
在DNA重组技术中,
Klenow片段作为DNA聚合酶,常用于cDNA第二条链的合成和标记双链DNA3′末端
。②DNA连接酶可催化DNA中相邻的5′-磷酸基和3′-羟基末端之间形成磷酸二酯键,使DNA切口封闭或使两个DNA片段连接。碱性磷酸酶的功能是切除DNA末端磷酸基。末端转移酶的功能是在3′-羟基末端进行同质多聚物加...
cDNA
文库的cDNA
答:
稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.2.
cDNA第二链的合成
1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10...
自身引导合成法和置换合成法
合成cDNA第二链的
优缺点是什么?
答:
1. 自身引导合成法首先,通过变性降解去除杂交分子中的RNA,使得单链cDNA的3'端形成发夹结构作为引物
。在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下,这个引物引导第二链的合成。然而,这种方法存在一些缺点:S1核酸酶在切割发夹结构时,可能导致mRNA 5'端序列出现缺失和重排。此外,如果S1核酸酶纯度不足...
简述
cDNA第
一链与
第二
条
链的合成
方法
答:
2:
第二链的合成
a:第一
链合成
完毕后,直接进行第二链的合成。在第一链合成体系中分别加入 2.5×第二链缓冲液40μl,DNA聚合酶Ⅰ23μ RNase H 0.8μ 加水至100μl b: 14-16℃下放置2小时。(>3Kb时反应时间延长至3-4小时)c:70℃,10min,点动离心,置于冰浴 d: 在样品管中加入T4DNA...
简述
cdna
文库构建步骤
答:
阶段2:
cDNA第二链的合成
1.将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中: 10 mmol/L MgCl2 70μl 2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl 10 mCi/ml[α-32P] dCTP(400 Ci/mmol) 10μl 1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl RNase H (1000单位/ml) 1μl 大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5...
合成cDNA第二
条
链的
U3-R-U5-PBS序列时,PBS序列是怎么合成的,以什么为模...
答:
合成cDNA
的第二条链肯定是设计引物后以
cDNA第
一链为模板进行扩增啊。cDNA第一链是通过RNA逆转录而来。所以实验顺序是:RNA提取——第一链cDNA合成——
第二链cDNA合成
。
RNA反转录的
cDNA
是单
链的
还是双链的
答:
一、
cDNA第二链的合成
:1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10×DNA Polymerase I buffer 6ul 10mM dNTP(自己配制)xul dd H2O 1ul RNase H(2U/ul)10ul DNA Polymerase I(10U/ul)总...
基因工程
答:
1,mRNA的纯化 mRNA的特点:3'末端含有一多聚腺苷酸组成的末端.方法:亲和层析法 2,cDNA第一链的合成 一般 mRNA都带有3'-polyA,所以可以用寡聚dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的合成.用放射性探针法检测.3,
cDNA第二链的合成
以cDNA第一链为模板合成第二链.4,cDNA克隆 用于cDNA克隆的...
求教
cDNA
制备的一般方法 RT,一般的步骤就行,
答:
根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始.三、
cDNA第二链的合成
1、自身引导合成法:单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为...
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