RT-
PCR检测方法的具体步骤如下:
(一)RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液:从Kit中取出RLT液,用1.5mL离心管分装,每管500μL(在体系配制区操作)。
2、在
生物安全柜内将采样液(鼻拭子、咽拭子、
胸水等)或病毒培养物(鸡胚尿囊液或
细胞培养液)取100μL加入RLT液管中,充分混匀。 3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇,混匀后依次加入600μL 70%的乙醇,充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管,打开包装将其做好标记。取步骤(3)中的混合液600μL加入滤柱中,12000rpm,离心15s,弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上,将步骤(3)剩余的混合液全部吸入滤柱中,12000rpm,离心15s,弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液,12000rpm,离心15s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管,将离心后的滤柱移到新的收集管上,于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液,12000rpm,离心15s。
8、弃收集管中的离心液,再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液,13000~14000rpm,离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上,向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water,室温静置1~3min。
10、12000rpm,离心1min,收集离心液即为提取的病毒RNA,立即做实验或-20℃以下保存。
注意:Buffer RPE使用之间加44mL
无水乙醇。
(二)反应体系配制
1、实验设计: 检测标本RNA
阴性对照:无菌水(标本RNA提取时,跟标本同时提取无菌水。) 阳性对照:已知病毒RNA
2、PCR反应体系配制(在体系配制区配反应液) 1)按下表加入试剂: PCR反应体系
对每一个建立的反应确定反应数(n=拟进行的PCR管数,包括阴性,阳性对)。考虑到阴性无模板对照,阳性对照,误差,制备过量的反应混合物是必要的。具体如下:
(1)如果包括对照,样品的数量(n)为1到14,那么N=n+1;
(2)如果包括对照,样品的数量(n)大于15,那么N=n+2。
2)将上述反应液混匀,分装到0.2mL PCR
小管中,每管20μL,分别做好标记。
3)加RNA模板(在核酸提取区)
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管(5μL无菌水),然后分别加标本RNA(每管5μL),最后加入阳性对照RNA(每管5μL)。
3、RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀,短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR 扩增。
4、RT-PCR产物检测
1)2.0%琼脂糖凝胶制备:称取2.0g Agarose,倒入耐热玻璃瓶内,再加入电泳液(1×TBE)100mL,轻轻混匀后加热,使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50~60℃左右,加入核酸
染料,轻轻混匀(不要产生气泡)。待胶温度降至50℃左右时,将其倒入制胶板,插好电泳梳子。待胶完全凝固(约30~60min)之后,将梳子拔出。
2)将制备好的电泳胶放入电泳槽(带梳子孔的一端在阴极),倒入电泳液(1×TBE)浸过胶面即可。
3)PCR产物各取10μL,加入2μL上样
缓冲液(6×Loading Buffer),混匀后加入电泳胶孔内(先加Marker(DL-2000)5μL,然后依次加标本PCR产物,再加阴性对照,最后加阳性对照产物)。 4)电泳电压100V,约30~40min后看结果。 5)将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。
5、结果判断。