慢病毒载体和腺病毒载体在介导外源基因表达方面表现出高转导效率，尤其适用于难转染或无法转染的哺乳动物细胞。在实验过程中，可能会遇到多种问题，以下是一些常见问题的解答，以供参考。
Q1：用于病毒感染的细胞接种量应如何调整？根据细胞大小和增殖速度，调整细胞接种量，确保感染后2至3天细胞几乎填满培养皿底部。对于大多数细胞系，保持接种密度在30%-50%左右，细胞在48小时后汇合度约为90%；对于生长缓慢的原代细胞，接种时可提高到50%-60%，确保感染后2天汇合度达到90%-100%；非分裂细胞如神经元细胞，应按照100%的汇合度进行接种。
Q2：如何确定加入病毒的最佳时间？慢病毒感染后48-72小时可观察到基因表达，腺病毒则为36-48小时，应在细胞汇合度30%-50%且细胞状态良好时加入病毒。
Q3：收到病毒后应如何保存？短期内使用，可于4℃保存，最好在一周内使用完毕；若需长期保存，按需分装后置于-80℃，避免反复冻融；如需液氮罐保存，则需使用专门的保存管。若病毒储存超过6个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。
Q4：病毒使用过程中如何进行稀释？取出病毒置于冰浴融解后，使用PBS或无血清培养基混匀分装，并在4℃保存（一周内使用最佳）。以慢病毒为例，如原病毒标记滴度为1x108 TU/mL，取10 μL至90 μL常规培养基中，即可得到1x107 TU/mL滴度的病毒。
Q5：解释MOI是什么？MOI，感染复数，表示病毒对细胞的感染能力，细胞需要的MOI值越高，细胞越难被感染。通常通过某株细胞80%被感染时所需要的病毒颗粒数与细胞数目的比值来确定MOI值。
Q6：感染悬浮或半悬浮细胞时，没有平角离心机应如何操作？感染悬浮或半悬浮细胞通常需要通过平角离心提高感染效率。若无平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，轻轻吹打混匀5-10下，室温放置15分钟（避免超过30分钟，每隔10分钟可再吹打一次），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿继续病毒感染。
Q7：对照病毒或目的病毒感染细胞后，细胞形态改变或死亡的原因？首先，检查细胞或病毒是否有污染；其次，确认MOI值是否过高，调整MOI值，并在感染后的4小时、8小时和12小时对细胞进行观察，若发现细胞状态变差，则使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液；排除污染和MOI值过高后，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转。
Q8：为何GFP荧光强度较弱？GFP慢病毒感染细胞后，荧光强度取决于病毒进入细胞的颗粒数、细胞的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP前的启动子活性等因素。荧光强度与启动子活性、目的细胞感染的病毒颗粒数成正比。在增殖较快的细胞中，GFP蛋白表达峰值出现在48-72小时；在增殖较慢的细胞中，则需更长时间。强启动子启动时荧光表达较强，弱启动子启动则较弱。
Q9：过表达病毒为何荧光较暗？不同类型的病毒有包装容量限制，插入基因会影响荧光蛋白等基因的表达。对照病毒或干扰病毒没有插入基因或插入基因短，荧光表达通常较强。插入较长基因片段后，荧光亮度会减弱，尤其是出现高GC片段，影响转录时，荧光强度降低。
Q10：为何需要长时间曝光才能观察到荧光？可能原因包括：显微镜汞灯使用时间长、pH值低、病毒荧光不亮。可排除显微镜问题、检查培养基是否发黄、延长曝光时间。
Q11：如何提高病毒对细胞的感染效率？提高感染效率受病毒活性、细胞状态、MOI值、感染时间等多个因素影响。确保病毒活性、进行预实验测试以确定病毒载体的适用性、调整MOI值、优化感染时间、在必要时添加助转剂如polybrene等。
Q12：如何选择慢病毒载体和腺病毒载体？慢病毒和腺病毒载体各有优势，选择取决于实验目的。考虑插入目的序列的大小、是否需要构建稳转细胞株、目的细胞类型等因素。
Q13：腺病毒扩增是否安全？腺病毒载体经改造，病毒在293细胞系外不自我复制，不整合基因组，显著降低了危险性。腺病毒对多种消毒剂敏感，但UV照射无法有效灭活，使用后的器皿或枪头需用84消毒液浸泡半小时后冲洗，方可丢弃或回收。
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