实验设计：消除环状DNA载体上的酶切位点

Question

某环状DNA载体上有一酶切位点，要从该载体切除该识别位点，且该位点位于某gene内，不能是其gene失活。
要求：实验原理（关键），器材，步骤（关键）
“不能是其gene失活”写错了个字，应该是“不能使其gene失活”
更多内容起寄往我的E-mail:shiyi720#163.com(请将#换成@，为了防止垃圾邮件，呵呵)注明你的百度ID号，我采用后好给你加分！

Answer 1

环状DNA载体，那就是质粒，或者粘粒什么的了。。

如果购买的是商业用载体的话，如果是多酶切位点那段的酶切位点去掉是不会不会使目的基因所表达的蛋白质失活的，但是如果是不在多酶切位点的话，就可能使其它的“框架”受到影响，比如amp抗性或者clo抗性的失效（致命影响后期筛选）等。

如果是多酶切位点的话，此区域的酶切位点不可能通过双酶切去掉，所以建议设计合理的pcr引物进行此敲基因操作，这个跟进行定点突变的原理差不多，所以只要设计一个引物就可以了，但是该试剂盒价格比较贵，在两万左右（20次反应），外加引物设计及后期测序要￥2500左右。

原理：
其实就是PCR反应原理：
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。通过设计特定的引物来达到改变基因的效果。

http://baike.baidu.com/lemma-php/dispose/view.php/2764.htm
http://baike.baidu.com/lemma-php/dispose/view.php/274624.htm

具体的说明电邮本人邮箱给你一份说明书吧。

实验器材：
PCR仪（用于pcr反应）、水浴锅（消化未突变质粒DNA）、菌种培养系列设备及实验耗材、试剂。

步骤：

设计引物——》交于生化公司合成引物——》PCR——》消化未突变DNA——》选择宿主菌——》高效感受态制备或购买——》转化——》amp或其它抗性平板涂布——》培养——》单菌落质粒提取——》筛选——》测序确认——》得到目的DNA。

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如果楼主想进一步了解的话可以通过邮箱跟我进行交流。

参考资料：水云深浪

Answer 2

我知道！我们生物书上有~
>限制性核酸内切酶的命名
用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称，如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示;如有株名，再加上一个字母，一种特殊的菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。
例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。

限制性核酸内切酶的分类
Ⅰ类限制性核酸内切酶? 由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。
Ⅱ型限制性核酸内切酶
与Ⅰ型限制性核酸内切酶相比， Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点是其切割位点在识别序列上与之靠近，并产生具有粘性末端或其它末端的一定长度的DNA片段。其三个基本特性如下：
在DNA分子双链的特异性识别部位，切割DNA分子产生链的断裂；2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此相对的；断裂形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。

限制性核酸内切酶的作用
限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同。
识别序列（切割位点、靶子序列）
绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶，都能识别4-8个核苷酸组成的特定核苷酸序列，我们称这样的序列为核酸内切酶的识别位点，限制酶就是从识别序列内切割DNA分子的。
有些识别序列是连续的，（如GATC），有些识别序列是断裂的（如GANTC），共同的特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，即回文结构。

Ⅱ型限制性核酸内切酶的靶子位点是多样的，靶子序列长度不一样的限制酶，对DNA分子的随机切割频率不同。
由限制酶的作用造成的DNA分子的断裂类型通常有两种：
两条链上的断裂位置是交错的、但是对称地围绕一个对称轴排列，这种断裂的结果是形成具有粘性末端的DNA片段；两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形成的是平末端DNA片段。
粘性末端，是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对重新环化，具平末端的DNA片段不易环化。
有两种类型的限制酶都可以产生粘性末端:一种是形成具有3’-OH单链延伸的粘性末端；另一种是形成具有5’-P单链延伸的粘性末端.

不过实验步骤没学过~

Answer 3

限制性核酸内切酶的命名
用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称，如大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示;如有株名，再加上一个字母，一种特殊的菌株，具有几个不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。
例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。

限制性核酸内切酶的分类
Ⅰ类限制性核酸内切酶? 由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。
Ⅱ型限制性核酸内切酶
与Ⅰ型限制性核酸内切酶相比， Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点是其切割位点在识别序列上与之靠近，并产生具有粘性末端或其它末端的一定长度的DNA片段。其三个基本特性如下：
在DNA分子双链的特异性识别部位，切割DNA分子产生链的断裂；2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此相对的；断裂形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。

限制性核酸内切酶的作用
限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同。
识别序列（切割位点、靶子序列）
绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶，都能识别4-8个核苷酸组成的特定核苷酸序列，我们称这样的序列为核酸内切酶的识别位点，限制酶就是从识别序列内切割DNA分子的。
有些识别序列是连续的，（如GATC），有些识别序列是断裂的（如GANTC），共同的特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，即回文结构。

Ⅱ型限制性核酸内切酶的靶子位点是多样的，靶子序列长度不一样的限制酶，对DNA分子的随机切割频率不同。
由限制酶的作用造成的DNA分子的断裂类型通常有两种：
两条链上的断裂位置是交错的、但是对称地围绕一个对称轴排列，这种断裂的结果是形成具有粘性末端的DNA片段；两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形成的是平末端DNA片段。
粘性末端，是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对重新环化，具平末端的DNA片段不易环化。
有两种类型的限制酶都可以产生粘性末端:一种是形成具有3’-OH单链延伸的粘性末端；另一种是形成具有5’-P单链延伸的粘性末端.

Answer 4

用dna切割酶将特定片段切掉,就可以了!不过每次只能切下特定的点
现在的高中教材上就有
www.yeeta.com

Answer 5

不好办啊
切了就会失活啊，如果这个基因在表达的时候，这段属于内含子，不会表达的话，那就行了。
呵呵，没怎么做过这种得，帮不了你太大忙了，不好意思啊

Answer 6

什么都不懂！！！