约翰首先使用“变量”这个词，并且使函数概念公式化．1698年他从解析的角度提出了函数的概念：“由变量x和常数所构成的式子叫做x的函数”，记作X或ξ，1718年他又改用φx表示x的函数．记号f(x）是欧拉于1734年才引进的．约翰对一些具体函数进行过研究，除一般的代数函数外，他还引入了超越函数，即三角函数、对数函数、指数函数、变量的无理数次幂函数及某些用积分表达的函数．指出对数函数是指数函数的反函数．
约翰对微积分的贡献主要是对积分法的发展．他曾采用变量替换来求某些函数的积分，在1699年的《教师学报》上给出了用变量替换计算积分
约翰还提出了现在微积分中的一个著名定理——洛比达定理（或法则），它是用导数求一个分式当分子和分母都趋于零（或无穷大）时的极限的．这个定理是由他的学生洛比达在1696年编写的一本非常有影响的微积分教材《无穷小分析》（Analyse des infi－niment petits）中引入的，后称为洛比达法则．这个法则实际上是1694年约翰给洛比达的信中告诉洛比达的．
1742年约翰出版了他的著作《积分学教程》（Lections mathe－maties de method integralium），在这本书中约翰汇集了他在微积分方面的研究成果，他不仅给出了各种不同的积分方法的例子，还给出了曲面的求积，曲线的求长和不同类型的微分方程的解法，使微积分更加系统化．这部著作成为微积分学发展中的一本重要著作，在当时对于推动微积分的发展和普及微积分的知识都起了积极的作用． 微积分的迅速发展和应用，必然导致了微分方程这门新学科的诞生．其实微分方程的发展是与微积分的发展交织在一起的．约翰在这方面也是一位开拓者．
1691年6月约翰在《教师学报》上发表文章，解决了他哥哥雅格布提出的“悬链线”问题，即“一根柔软而不能伸长的绳子自由悬挂于两固定点，求这绳所形成的曲线”．约翰设法列出了该问题的微分方程
其中s是由B点到任一点A之间的弧长，而a是A点处绳的张力在水平方向的分量与单位绳长重力的比值．通过解此方程就得到悬链线的方程
在此基础上，约翰与雅格布还在1691—1692年间解决了悬挂着的变密度非弹性软绳、等厚度的弹性绳、以及在每一点上的作用力都指向一个固定中心的细绳所形成的形状的问题．
约翰和莱布尼兹在1694年引进了找等交曲线族的问题，即找一曲线或曲线族，使得与已知曲线族相交成给定的角．约翰称等交曲线为轨线．他将这个问题作为向雅格布的一个挑战．雅格布只解决了一些特殊的实例，约翰导出了一特殊曲线族的正交轨线的微分方程，并在1698年找到了它的解．这个问题后来由莱布尼兹与雅格布的学生J．赫曼（Jacob Hermann）得到较完美的解决．
在求解1695年雅格布给出的“伯努利方程”
y′+P(x)y+Q(x)yn=0
1727年，约翰在一篇论文中研究了弦振动问题，考虑一根无重量的弹性弦，在弦上等间隔地放置着n个等质量的质点，当放置6个质点时，从而证明了在任何时刻弦的形状必定是正弦曲线．这一事实也出现在约翰给他的儿子丹尼尔的信中．约翰后来还解决了一个抛射体在阻力正比于速度的任何次幂的介质中运动的问题。 变分法的产生和发展，最初来自三大问题：最速降线问题，等周问题和测地线问题．约翰在这些问题的研究中都做出了贡献．
约翰在1696年6月号的《教师学报》上提出了一个作为向雅格布和欧洲数学家挑战的题目：设不在同一铅直线上的两点A与B，使一质点只在重力的影响下从A点滑向B点，求所需时间最短的途径（摩擦和空气阻力不计）．这就是最速降线问题．对这个问题，牛顿、莱布尼兹、洛比达、雅格布·伯努利和约翰·伯努利都得到了正确的解答．最速降线是一条联结A，B两点的上凹的旋轮线（又称圆滚线或摆线）．他们的答案相同，而解法各异．除雅格布的解法外，其他人的解法都发表在1697年5月号的《教师学报》上．后来欧拉和J．L．拉格朗日（Lagrange）给出了这类问题的一般解法．在这个问题的解决过程中，显示了约翰的才能，他是通过机灵的直觉解决这个问题的．他将这一机械问题，通过已有的费马最小时间原理的分析转化为光学问题，从光的折射定律推出了旋轮线的微分方程．雅格布从另一个角度给出了一个较麻烦但更一般的解法．伯努利兄弟对旋轮线是最速降线问题的解感到惊奇和振奋，约翰说：“我们之所以钦佩惠更斯，是因为他首先发现了在一个旋轮线上的大量质点下落，它们总是同时到达，与质点的起始位置无关紧要．然后，当你听到我肯定说旋轮线就是惠更斯的等时曲线的时候，可能惊讶得简直发呆．等时曲线是最速降线我们看得很清楚．”
在1697年5月号的《教师学报》上，雅格布·伯努利提出了一个含几种情形的相当复杂的等周问题（即在给定周长的所有封闭曲线中求一条曲线，使得它所围的面积最大），作为向约翰的挑战．约翰开始过低地估计了这个问题的复杂性，没有弄清这个变量问题的特性，所以在1697年和1701年两次给出的解答都没有得到成功，这受到了雅格布无情的批评．1700年5月雅格布在《教师学报》上发表了关于等周问题的解，指出这条曲线是一个圆．1718年，约翰继续研究了等周问题，他沿着雅格布的思路，改进了雅格布的解法，在《科学院论文集》（Memoires de l’Académie dessciences）中约翰的论文给出了一个精确的、形式上漂亮的等周问题的解法．这篇论文包含了关于变分法的现代方法的核心，提出了变分法的一些概念，奠定了变分法的基础．
约翰与他的哥哥雅格布还对测地线问题进行了研究．测地线是指曲面上两点间长度最短的路径．1697年，约翰在《博学杂志》（Journal des scavans）中，提出了在凸曲面上求两点间的最短弧问题，1698年8月26日，他还写信给莱布尼兹，谈到他觉察到的测地线的特有的性质．1698年，雅格布解决了锥面和旋转面上的测地线问题，1728年约翰又用雅格布的方法取得了一些进展，并且求得了另外几类曲面的测地线．由于在最速降线问题、等周问题及测地线问题的研究中约翰的出色工作，使之成为变分法的先驱者之一．
此外，约翰在数学的其他领域，如解析几何等学科中，也做过一些有益的工作．1715年约翰在给莱布尼兹的信中引进了现在通用的用三个坐标平面建立空间坐标系的方法，提出了用三个坐标变量的方程表示曲面的方法． 约翰不仅在纯数学方面做了大量的工作，而且他在把微积分应用到物理学特别是力学和天体力学方面所作的著述，也有很高的价值．
约翰对一些力学上的概念作出了准确的解释．1714年，他发表了《军舰操作技术原理》（Theorie de la manoeuvre des vaisse-aux），在这本书中，他澄清了笛卡儿理论中关于力与“能量”（当时称为vis viva）的混乱．1715年，他又提出了所谓虚拟（virtual）速度原理。
727年，他发表了论文“论运动的交换规律”（Discourssur leslois de la communication du mouvement），在这篇论文中，讨论了行星的椭圆轨道和行星轨道的倾斜度．但是在引力理论方面，由于他的偏见，不支持牛顿的理论，而且为笛卡儿的旋涡理论辩护，推迟了牛顿力学在欧洲大陆的传播．
在实验物理方面，他研究了光学现象，提出了焦散面理论．在1692年的《教师学报》中，他得到了某些焦散面方程，例如当一束平行光线投射到球面镜上时，从球面上反射出来的光线的焦散面方程．他还把最速降线问题的研究扩展到了可以确定光线在各种不同密度的介质中所通过的路径．他还研究了弦振动问题及水力学等问题，提出过二阶甚至三阶的方程．
约翰·伯努利是17—18世纪在欧洲有影响的数学家．约翰在他的科学生涯中，采用通信等方式与其他科学家建立了广泛的联系，交流学术成果，讨论和辩论一些问题，这是他学术活动的一大特点．他与110位学者有通信联系，进行学术讨论的信件大约有2500封，这大大促进了学术的发展．约翰一生另一特点是致力于教学和培养人才的工作，他培养出一批出色的数学家，其中包括18世纪数学界中心人物欧拉，这不能不说是约翰·伯努利的功绩之一．
