基因干扰常用方法有哪些

Question

如题所述

Answer 1

RNA干扰的分子抑制机制的三种方式及原理
转录抑制
与RNAi有关的dsRNA及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，使相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能表达。这种在转录水平上阻断基因功能，使基因沉默的RNAi方式被称为转录基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。这种现象先在植物中得到证实,但是在哺乳动物中是否存在仍有争议。2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母细胞中，通过RNAi引起靶基因表达沉默的长dsRNA不能引起相应DNA区域从头合成DNA的甲基化。Morris等也于同年得出实验结论，针对内源基因启动子的siRNA能够引起其区域内CG岛以及组蛋白H3K9的甲基化，从而在转录水平抑制基因的表达。
转录后抑制
不同来源的dsRNA通过各种转基因技术转入植物、线虫或哺乳动物细胞内，、被切割产生siRNA片断，再由合成的RISC切割靶mRNA从而阻断基因表达。这种基因能正常转录成mRNA，但mRNA因被降解使基因功能被阻断，这种RNAi方式叫做转录后沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGS)。siRNA对靶mRNA降解具有序列特异性，只能引起同源mRNA降解，如果siRNA与mRNA有一个bp不配对，RNAi作用就极大降低，如果两者有4个bp不配对，就不能产生RNAi。
翻译抑制
Grishok等在研究RNAi时，发现在细胞中在细胞中存在内源性小片段单链RNA(ssRNA)，其长度也在21～25 nt之间，这种ssRNA可与mRNA的3′非翻译区(3′UTR)特异性地结合，从而抑制mRNA的翻译和相应的功能蛋白质合成。这种小片段的ssRNA叫做stRNA(small temporal RNA)。ssRNA的形成是因为当RNA的大小为70～80 nt时，容易形成双链的茎环状结构，其双链茎的长度正好在21～25 nt之间，这样的双链结构易被Dicer酶识别并切割成stRNA，由stRNA抑制翻译。这种方式的RNAi也作用于转录后形成的mRNA，它在调节生物细胞内基因的表达、自身的发育方面起着重要的作用。

Answer 2

基因干扰（Gene interference）是指采用特定方式阻止或抑制致病基因的表达，以达到治疗疾病的目的。基因干扰目前应用广泛的是通过RNA干扰（RNAi）技术来下调目的基因表达。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的，导致同源mRNA发生高度特异性降解的现象。是一种RNA转录后调控基因表达的机制。
目前在细胞水平上的RNAi主要有三种方式：siRNA、shRNA质粒和shRNA病毒。在RNAi应用中，shRNA文库构建是RNAi文库构建中的中间环节，shRNA的设计尤为重要。
另一种利用基因干扰机制调控基因表达元件是反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides，ASOs）。是一段由12-25个核苷酸组成的单链DNA或RNA小片段序列，能够针对性的阻断目的基因的转录或者翻译过程，从而达到基因调控的目的。