核糖体展示技术的原理

Question

如题所述

Answer 1

核糖体展示技术通过聚合酶链反应 （PCR）扩增DNA文库，同时引入T7 启动子、核糖体结合位点及茎-环结构， 将其转录成 mRNA， 在无细胞翻译系统中进行翻译， 使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面， 形成 “mRNA-核糖体-蛋白质” 复合物， 构成核糖体展示的蛋白文库， 然后用相应的抗原从翻译混合物中进行筛选， 以乙二胺四乙酸 （EDTA） 解离结合的核糖体复合物或以特异抗原洗脱整个复合物，并从中分离mRNA。通过反转录聚合酶链反应（RT- PCR） 提供下一轮展示的模板， 所得 DNA进入下一轮富集，部分 DNA可通过克隆进行测序分析等。
Kawasaki 曾建议采用类似的途径从肽库 中筛选多肽配体。在此之前 ， 利用前期多肽抗体进 行免疫沉淀 ， 已经分离到了与核糖体和多肽偶联的mRNA。 Mattheakis等人首次将前 人的设想付诸 实践，建立了筛选多肽类配体的多聚核糖体展示技术，并从一个库容为10^12的肽库中，筛选到亲和力常数达到10^9 (nmol级) 的固定化 单抗 的多肽 配 体。 Gersuk等人利用该技术也筛选到前列腺癌肿瘤标记的多肽配体。体外翻译时，蛋白或多肽的折叠与 翻译同步进行u。与核糖体结合的天然多肽也具有酶活性。这些研究结果说 明， 如果某种蛋 白质 的折叠不受核糖体蛋 白通道的影响， 那么与核糖体的 解离就不是该蛋 白获得天然构像的必要条件。1 9 9 7 年，Plückthun实 验 室 在 以上 研 究 成 果 的 基 础 上 ， 对 M a t t h e a k i s的多聚核糖体展示技术 进行 了改进， 建立了体外筛选完整功能蛋 白( 如抗体 ) 的新技术 ：核糖体展示技术。