为了使基因片段能有效转录和翻译,5′端应接上T7启动子序列和SD序列，去掉3′端的终止密码子,从而成功地使核糖体停留在mRNA3′末端,将蛋白质和mRNA连接在一起。在对基因片段改造时,常进行多次延伸PCR：
①分别将需要的基因片段和间隔序列各自扩出来
② 用引物 4 和引物 5 做连接 PCR 将目的基因和间隔子连接起来，引物5含有SD序列, 引物4含有3′端茎环结构序列。
③ PCR产物再进行延伸PCR,引物6含有T7启动子序列和5′端茎环结构序列,下游产物同前。最后得到的PCR产物,5′端接上T7启动子和茎环结构以及SD序列,3′端则融合了间隔序列并含有3′端的茎环结构 1）体外表达可以利用来自原核的E.coliS30无细胞蛋白质合成系统,或真核的兔网织红细胞裂解液和麦胚提取物的蛋白质合成系统,至于何种系统更适合,目前尚有争议.体外转录与体外翻译可以偶联进行,也可以分别进行.目前,已有以DNA 为模板的体外蛋白翻译系统和以RNA为模板的体外转录与翻译偶联的商用系统问世。
对于含二硫桥的ScFv抗体和其他蛋白质,转录和翻译应分别进行,因为含有二硫桥的蛋白质要在氧化条件下才能正确折叠,但转录时,T7 RNA聚合酶要求具还原性的β-巯基乙醇维持其稳定性。如果目标蛋白在还原性条件下能正确折叠,则体外转录/翻译偶联体系效果可能更好.。
2）若分别进行,则需要控制RNase的影响.VRC—过渡态类似物—作为RNase抑制剂,能有效抑制核酸酶,提高E.coli核糖体展示效率。翻译结束后立即冷却反应混合物,所有筛选步骤在冰上进行降低RNase的影响。另外,3′端和5′端的茎环结构也可以使mRNA避免核酸外切酶RNaseⅡ和核酸内切酶RNase E的影响。 体外翻译反应结束后,将翻译混合物稀释4倍终止反应。反应试剂中始终保持5 mmol/L Mg2+浓度，稳定mRNA-核糖体-蛋白质三元复合体。可以直接用于筛选实验，也可以于4℃保存，核糖体复合物在4℃至少可以稳定10 d，但产量会逐渐减少。体外筛选时加入1%~2%脱脂奶粉和0.2%肝素可以降低抗原-抗体的非特异性反应,肝素还能抑制核酸酶。
①亲和筛选
分为固相筛选和液相筛选，主要有ELISA和磁珠法。Hanes等认为,ELISA方法中，抗原包被在塑料表面上，而塑料表面的疏水作用有可能会影响吸附蛋白的空间构象，从而导致筛选出的抗体分子不能识别抗原的天然表位;磁珠法是在抗原上连接捕获标签，如生物素，然后在形成抗原-抗体复合物后,采用磁珠-链霉亲和素捕获该标签,进行亲和筛选。
②mRNA的分离
筛选完后，加入含20 mmol/LEDTA的冰冷缓冲液洗脱mRNA。洗脱下来的mRNA用DNaseⅠ处理去除残留的DNA模板，进行RT-PCR反应重新引入T7启动子，SD序列等核糖体展示必需元件用于下一轮展示或直接进行Northern杂交，评价筛选效率。将最后一轮筛选到的靶标基因与质粒连接,转化到大肠杆菌中，可以得到单个靶标克隆。进一步采用体外或体内(分泌型或包涵体型)表达方式表达单链抗体分子,进行活性鉴定。 用核糖体展示技术对未变异的文库进行筛选时,可以通过易错PCR或(DNA shuffering)等方法引入突变和重组技术,增加分子多样性,从而提高获得高亲和力、良好稳定性或增加酶活性靶标分子的机率.Plückthumx小组利用核糖体展示技术筛选到1.1 nmol高亲和力的ScFv,之后通过引入DNA重排技术,又将其亲和力提高。
