溶液I的作用 首先要控制好Tris-HCl溶液的pH和浓度;50 mM葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此,如果溶液I中缺了葡萄糖实对质粒的抽提本身而言,几乎没有任何影响。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA,是要把大肠杆菌细胞中的Ca2+和Mg2+等所有二价金属离子都螯合掉,抑制DNase的活性,和抑制微生物生长。如果不加EDTA,也没太大影响,只要是在不太长的时间里完成质粒抽提,就不用怕DNA会迅速被降解,因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。注意:菌体一定要悬浮均匀,不能有结块。
溶液II 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH,是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。因为破碎细胞主要是碱的作用,而不是SDS,所以才叫碱法抽提。用了不新鲜的0.4 N NaOH,即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌,自然就难高效率抽提得到质粒;加SDS是为下一步操作做铺垫。这一步要记住两点:第一,时间不能过长,千万不要这时候去接电话,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA也会断裂。